时间安排

实训项目

具体内容

第一天

消毒与灭菌

无菌器材的准备

样品的稀释

无菌室的消毒灭菌使用

紫外线消毒🚵🏽、干热和湿热灭菌

无菌器材的准备

无菌操作样品的稀释

第二天

培养基制作

细菌分离培养技术

伊红美蓝基配制

斜面接种🦡、划线分区接种

第三天

细菌简单染色

细菌革兰氏染色

细菌涂片技术

细菌简单染色、细菌革兰氏染色

镜检技术

第四天

水样标本细菌菌落总数测定

综合训练📦，完成检测实验

第五天

综合测试

测试无菌操作及染色技术👩🏿‍⚖️、镜检技术

第六天

细菌菌落总数测定

细菌菌落总数测定结果及分析

项目

考核内容

操作标准

准备

正确准备

准备：穿着实验服，戴上橡胶手套👯、口罩，正确在血平板和待接种管做编号

无菌

无菌操作

无菌🦌：左手持培养皿，打开皿盖约45-60°角🏑💅，右手持接种环🧏🏻‍♀️，在酒精灯8-10cm范围内进行无菌操作🙎🏽‍♂️。

接种环

使用

灭菌🧏🏻‍♂️、冷却、取菌

灭菌😮‍💨：点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环柄📻，将接种环垂直放在内焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红👌🏽，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍☝️，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底🦜；

冷却👨‍🎤：灼烧后的接种环需冷却，可触及琼脂表面无菌处或平皿盖处冷却（注👨‍🔧：为评分标准的统一化，冷却操作动作需明显，不可在空气中冷却♟，防止引歧义，以下提到冷却均统一操作）💇🏼‍♂️；

取菌👰🏻🦥：冷却后的接种环挑取单个标本菌落👨‍✈️，且培养基无划破🧛‍♂️。

分区

划线

第一区

第一区：将标本均匀涂布于平板边缘，约占平板的1/5，同时确保培养基无被划破🫴，对接种环进行彻底的灼烧灭菌🗳；

第二、三、四区

第二区👃：调整培养皿至适合操作的位置🪧，灼烧后的接种环冷却（注：同上）🚐，将接种环通过第一区3-4次😈，进行连续不重叠划线，均匀流畅，培养基无划破，对接种环进行彻底的灼烧灭菌；

第三区：调整培养皿至适合操作的位置👷🏿‍♀️，灼烧后的接种环冷却（注：同上），将接种环通过第二区3-4次👩🏽‍🏭，进行连续不重叠划线，均匀流畅，培养基被划破💃🏽，对接种环进行彻底的灼烧灭菌🦅；

第四区：调整培养皿至适合操作的位置，灼烧后的接种环冷却（注：同上）🧑‍🎨，将接种环通过第三区3-4次，进行连续不重叠划线，均匀流畅🏌🏽‍♀️，不与第一区交叉，培养基无划破，对接种环进行彻底的灼烧灭菌⛹️‍♂️，放置试管架上，培养皿需倒置。

斜面

接种

手持试管及

接种环

将菌种管与待接种管持在左手拇指🧑🏼‍🚀、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后🤽，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～60度角📇。右手持接种环进行灼烧灭菌（同上）。

接种

用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管塞，将试管口缓缓过火灭菌😖。

将灼烧灭菌的接种环伸入菌种管内🧱，先接触无菌落生长的培养基，待冷却后再从斜面上挑取少许菌落，在火焰旁迅速伸入接种管，在斜面底部自下而上划一条线，再从底部向上做S形划线。接种完毕，取出接种环，灼烧试管口及管塞🧑🏻‍🦼‍➡️，并在火焰旁将管塞旋上，再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧管塞。

培养

倒置培养皿

操作结束🧅，将待接种管和倒置的血平板置于35-37℃培养箱进行18-24h的培养🙍🏻。

文明

操作

实验台面清理

操作过程未造成培养基、桌面🧘🏿‍♂️、身体衣物及环境污染，熄灭酒精灯🕵🏿🧔🏿‍♂️，清理桌面上的实验废弃物🩷。

项目

考核内容

操作标准

制片

滴加无菌生理盐水

涂片🤛🧗：取一洁净的载玻片，滴一小滴生理盐水于载玻片中央👩🏻‍🦰，按无菌操作要求（注：单手持无菌培养皿🙊，打开皿盖约45°角，另一手持接种环🧑‍🏭，在酒精灯8-10cm范围内进行操作）🦶🏼，用接种环挑取少量细菌于玻片中央水滴中💂🏻，均匀涂布💖，形成直径约为1-1.5cm的菌膜，要求涂片薄而均匀。（注：涂片是否均匀将在镜检中进行判定）

干燥：为在规定时间内完成操作，可以利用酒精灯火焰温度干燥涂片，注意不能太靠近火焰（应在酒精灯火焰上方约半尺处），在固定之前要保证菌种细胞活性🙅🏽。

接种环的使用

涂片⛹🏽‍♂️、干燥

固　定

固定：涂片干燥后🥗，以钟摆速度将玻片（菌膜面朝上）通过酒精灯火焰3次，进行固定。   

革兰氏染色

初　染

初染🏜：用结晶紫染液（使用塑料吸管🕊，下同）覆盖涂菌部位，染色10s🗜，水洗至流出水无色

媒染：用卢戈碘液覆盖涂菌部位10s🚣🏻，水洗至流出水无色。   

脱色💃🏼🐜：用95%乙醇脱色（持续10-20s），稍后立即洗去乙醇。   

复染👩🏼‍🦳🤬：用沙黄染液染色10s，水洗至流出水无色。

媒　染

脱　色

复　染

干  燥

干燥📗：为在规定时间内完成操作🦦👟，可以利用擦镜纸吸去玻片上残余水珠，进行干燥。

镜检 

显微镜的使用

①载玻片安置：移开镜套🤟🏿，插上电源🧑🏿‍⚕️，打开显微镜，将载玻片放置于载物台上并用标本夹夹住🈯️；

②调节光源🚰：调节光源到适当的照明强度

③低倍镜观察：移动推进器使观察对象处于物镜的最下方，转动粗准焦螺旋，在视野中寻找物像，再略微转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰⚰️。

④油镜观察🤽🏿‍♂️：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心🌖，将低倍镜转离工作位置，在待观察的目标区域滴上一滴香柏油，将油镜转到工作位置🚗，油镜镜头此时应正好浸泡在镜油中☝️🌕。调节照明使视野的亮度合适，微调细准焦螺旋使物象清晰。

染色结果判断

染色结果判定👭🏻：在实验结果记录表上完成对染色细胞形状（球状或杆状）和颜色（紫色或红色）的描述👭🏻，并判断细菌属于革兰阳性菌或革兰阴性菌。

显微镜清洁和归位

镜检完毕处理🏃🏻‍♂️：

①缓慢下降载物台至最低位置，调节光源到最暗，关闭电源开关💂🏻。

②取下载玻片🚴。

③清洁显微镜🈹：先用擦镜纸擦去油镜镜头上的香柏油，再用沾有少许二甲苯的擦镜纸擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸抹去残留的二甲苯（注🫙：需要按同一个方向擦洗镜头）。

④清洁后，将物镜转成八字形👨‍🦽‍➡️，将推进器归位，拔下电源👂🏽，罩上镜套🦆。

文明

操作

实验后台面整理

操作结束🌐🧑🏼‍🎤，将载玻片放入消毒液中，用酒精灯盖子熄灭酒精灯（注🧔：酒精灯应在制片结束后立即熄灭）🕰，清理桌面上的实验废品🤜🏽。

器皿破损

细菌革兰染色显微镜观察结果记录

形状描述：

细菌细胞颜色👨🏼‍🏫：

结果判断：

项目

考核内容

操作规范

称量

天平的准备

调节电子天平水平泡至中间位置。

称量前应先将电子天平调零📦。

称量操作

称量纸的边角应对折防止培养基撒出🌺。

获取不同的培养基成分应使用不同的药匙，不同的称量纸，防止交叉污染。

药品称量完成后应盖好瓶盖并放回原位。

天平使用后应关机🦍、清扫天平盘。

溶化

培养基溶化

先用量筒量取300ml蒸馏水，加入1/2左右的水到烧杯中，置于电热套上加热。先将蒸馏水加热是为了节省时间保证实验能够在规定时间内完成🤸🏼‍♂️。此步骤可在称量前进行。

将培养基各种成分按配方称量好后，应及时放入烧杯中，防止部分培养基受潮粘在称量纸上。

培养基在溶解过程中需不断搅拌,防止培养基粘到烧杯底部引起培养基烧焦，溶解过程要注意调整火力防止培养基溢出🕵️，溶解至培养基澄清无沉淀，表明培养基溶解彻底。

将量筒内剩余的水加入到以上培养基中，搅拌混合均匀。

调酸

碱度

PH的测定

用玻璃棒蘸取少量培养基🛝，在试纸一端点一下即可，根据酸碱度利用1mol/L NaOH和1mol/L HCl进行调节PH。

调节PH时需将培养基转移到烧杯中便于搅拌混匀,调PH值时，边滴加试剂边搅拌🦇，并随时用PH试纸测量🛟。

分装和包扎

分装

根据分装量可选择不同的量筒分装，分装过程中应注意操作防止培养基洒出。

本实验提供250ml的三角瓶用于分装培养基，一般装液量为100ml左右。

分装时应避免培养基粘附瓶口，以免引起污染🧈。

包扎

分装完成后包好封口膜后，外面包牛皮纸一层或旧报纸二层，用绳正确捆扎，不打死结😇。

包扎完成后可在牛皮纸或报纸上面标注培养基名称、制备日期及制备人编号，并贴上灭菌指示带便于灭菌结束后判断培养基是否灭菌完全👨🏼‍🏫🧝🏽‍♀️。

灭菌

灭菌锅的

使用

首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水🧑🏼‍🌾，使水面与三角搁架相平为宜。一般来说每次灭菌前都应该加水。加水不能太少，否则会引起烧干或者爆裂。 加水最好加去离子水或蒸馏水🧝‍♀️，这样产生的水垢少些🔪🍃，而且锅体不容易被腐蚀。

放入培养基，加盖并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内🪟🍔。然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺栓🦻🏿，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

盖严锅盖后接入电源，打开排气阀排气，准备灭菌。因时间限制，本实验将这一步作为实验完成标志🕛。

文明

操作

实验后台面整理

台面的整理包括将各药品归位，以及实验台的整理等。

器皿破损

器皿破损主要指操作过程出现的玻璃板👆、烧杯🙅🏿‍♀️、三角瓶等器皿的损坏情况。

项目

 考核内容

操作标准

菌  落  总  数  的  测  定

编号

用油性标记笔在所需的试管和培养皿皿底上做好标记，以便区分。

稀释

用10ml的无菌吸管吸取9ml无菌生理盐水到无菌试管中🎅🏽，用1ml无菌吸管吸取1ml水样🧎‍♂️‍➡️，沿管壁缓慢注于盛有9ml无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液面），在涡旋振荡器上使其混合均匀🙎🏻‍♂️，制成1:10的样品匀液。

加样、对照

选择原液和1:10这两个稀释度的样品匀液进行检测🧝🏽‍♂️。吸取1ml样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿，同时🙇🏼‍♂️，吸取1ml空白稀释液加入到一个无菌培养皿内作空白对照🔌🦶。注意无菌吸管的合理利用，以免重复浪费。

制备平板

及时将15—20ml冷却至46℃的营养琼脂（事先置于46℃水浴锅）倾注到培养皿🆙，并及时转动培养基使其混合均匀，以免培养基开始凝固后再混匀达不到效果。混匀时注意力度，勿使培养基污染皿盖或溢出⏲。

培养

培养基未凝固时，培养皿应轻拿轻放，水平静置，待其凝固后方可倒置。

倒置培养皿后🦏🫄🏻，将培养皿置于恒温培养箱中👩‍❤️‍💋‍👩，培养温度为36℃±1℃，培养时间为48h±2h。（口述培养温度、时间）

文明

操作

实验台面

整理

等待培养基凝固的同时，利用等待的时间，整理实验台面。将废弃物扔至垃圾桶，已使用的吸管置于回收筒内。用酒精棉球擦拭污染的桌面（培养基若未溢出🍁，可免擦拭）💚。